El Obispado de Valparaíso fue creado el 18 de octubre de 1925 por la Bula “Apostolici muneris ratio”, del Papa Pío XI, desmembrado de la Arquidiócesis de Santiago. Su primer Obispo fue Eduardo Gimpert Paut, designado por el Santo Padre en 1926. En sus 11 años de pastor a cargo de la diócesis debió ocuparse de su organización, así como también de las diferentes ramas de la Acción Católica, motor pastoral de primera importancia en ese tiempo. Creó además las Parroquias del Carmen (Cerro Bellavista), Chorrillos (actual Benedictinos), Quintero y Villa Alemana.
En marzo de 1928 fundó la Universidad Católica de Valparaíso y levantó la obra gruesa de la Iglesia Catedral. Se caracterizó por desarrollar una vasta labor en el campo educacional, religioso y de beneficencia. Falleció en agosto de 1937 a los 70 años de edad.
Luego de la muerte de Monseñor Gimpert fue designado como Vicario Capitular don Prudencio Contardo hasta que tomó posesión de la diócesis Monseñor Rafael Lira Infante el 11 de junio de 1938. Este pastor se caracterizó por conocer y recorrer todo el territorio diocesano. Administraba personalmente los bienes de la Iglesia y se preocupó de finalizar las obras de la Catedral iniciadas por su antecesor. Falleció en 1958 a los 79 años tras una breve enfermedad.
El 24 de octubre de 1959 Monseñor Raúl Silva Henríquez sdb. fue nombrado Obispo y el 29 de noviembre de ese año asumió la diócesis en un acto celebrado en la Catedral de Valparaíso. Su dedicación pastoral a todas las instituciones diocesanas conquistó el cariño de los porteños. Se dedicó especialmente a la educación de la juventud. El 12 de mayo de 1961 fundó el Liceo José Cortés Brown, que dependió en los primeros años del SS. RR. Desarrolló e impulsó tareas pastorales entregando nuevas responsabilidades a los laicos en colegios y parroquias. Trabajó con los pobladores, campesinos, obreros y estudiantes. Impulsó Cáritas-Chile organizando un plan de ayuda fraterna a través de parroquias y escuelas. Luego del terremoto del 20 de mayo de 1960 organizó la campaña “Construyamos con Dios”, con un gran programa de solidaridad a través del precepto del 1%. El 25 de abril fue promovido al Arzobispado de Santiago, haciendo entrega de la diócesis el 24 de junio de 1961 a Monseñor Emilio Tagle y suceder en el rango de Cardenal a Monseñor José María Caro.
El nuevo pastor se preocupó, entre otras cosas, de la parte estructural de la diócesis; es así como fundó 19 parroquias, construyó nuevos edificios para la Universidad Católica de Valparaíso y creó la Sede de Viña del Mar del Colegio Seminario San Rafael. Otra obra suya fue la creación de la Vicaría de la Educación, sin embargo su más grande ocupación fueron las vocaciones sacerdotales por las que trabajó durante toda su vida. En 1969 fundó el Seminario Pontificio Mayor San Rafael, dedicando todos sus esfuerzos en una campaña permanente en favor de las vocaciones sacerdotales y religiosas.
El 3 de mayo de 1983 la Santa Sede comunicó a Monseñor Francisco de Borja Valenzuela Ríos su designación como Obispo de Valparaíso, asumiendo el cargo el 24 de junio. Desarrolló una vasta labor, especialmente en el área pastoral. Reestructuró la organización de la diócesis, destinó sacerdotes a las parroquias desatendidas y convocó a un Sínodo Diocesano para revisar la tarea de la Iglesia en Valparaíso. Su período se prolongó hasta el año 1993, ya que el 16 de abril fue nombrado Obispo de Valparaíso Monseñor Jorge Medina Estévez, quien asumió el cargo el 9 de junio de 1993. Monseñor Medina alcanzó a estar sólo tres años en el cargo, ya que fue nombrado Cardenal por el Vaticano.
El 24 de septiembre de 1996, en la fiesta de la Virgen de La Merced, Patrona de la Diócesis de Valparaíso, el Santo Padre nombró Obispo a Monseñor Francisco Javier Errázuriz Ossa, quien asumió el cargo el 10 de noviembre del mismo año, sin embargo, al igual que su antecesor, alcanzó a estar muy poco tiempo, porque el 24 de abril de 1998 el Papa Juan Pablo II lo nombró Arzobispo de Santiago tomando posesión de esa Arquidiócesis el 17 de mayo de ese año.
La diócesis debió esperar varios meses la nominación de un nuevo Obispo hasta que el 4 de diciembre de 1998 fue designado Monseñor Gonzalo Duarte García de Cortázar ss.cc, quien en ese momento desempeñaba la labor de Obispo Castrense. Su gestión se extendió hasta el 11 de junio del 2018.
Desde el 11 de junio de 2018 se encontraba en sede vacante, luego de la renuncia de monseñor Gonzalo. Su administrador apostólico sede vacante ad nutum Sanctae Sedis era monseñor Pedro Ossandón, obispo auxiliar de Santiago de Chile, hasta el 8 de junio de 2021, cuando el Papa Francisco nombró a Mons. Jorge Patricio Vega Velasco como Obispo de Valparaíso. El 15 de julio Mons. Jorge Patricio Vega Velasco tomó posesión de la Diócesis de Valparaíso en una Eucaristía celebrada en la Iglesia Catedral de Valparaíso.